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enLbCas12a Nuclease
| 貨號(hào) | 32135 | 售價(jià)（元） | 詢價(jià) |
| 規(guī)格 | 100pmoL/1000pmoL | CAS號(hào) |
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產(chǎn)品簡(jiǎn)介
enLbCas12a（enhanced LbCas12a）是一種基于野生型LbCas12a核酸內(nèi)切酶升級(jí)改造獲得的高活力LbCas12a突變體。與野生型LbCas12a的作用機(jī)制一樣，enLbCas12a也通過crRNA介導(dǎo)，靶向識(shí)別帶有PAM序列（5’-TTN-3’）的雙鏈DNA，使DNA雙鏈斷裂并產(chǎn)生粘性末端。同時(shí)，enLbCas12a對(duì)單鏈DNA靶標(biāo)的識(shí)別和剪切不依賴PAM序列。雙鏈或單鏈DNA靶標(biāo)均能激活enLbCas12a的反式剪切活性(即旁路剪切活性/附屬剪切活性)，即當(dāng)enLbCas12a酶與crRNA、靶標(biāo)DNA結(jié)合形成三元復(fù)合物后，便會(huì)被激活針對(duì)非特異ssDNA序列的反式剪切活性，將體系中的ssDNA序列切碎。因此，enLbCas12a酶不僅可用于體外dsDNA的特異剪切，也可用于靶標(biāo)核酸的快速檢測(cè)。
產(chǎn)品組分
| 組分 | 32135-01 (100 pmol) | 32135-03 (1,000 pmol) |
 enLbCas12a Nuclease (10 μM) a |
100 pmol | 1,000 pmol |
 10×HOLMES Buffer for Cas12a |
1 mL | 1 mL |
a. enLbCas12a Nuclease濃度為10 μM，即10 pmol/μL；100 pmol規(guī)格的總體積為10 μL，1,000 pmol規(guī)格的總體積為100 μL；
保存條件
-80℃或-20℃儲(chǔ)存；干冰運(yùn)輸。
活性定義
在總體積為20 μL的1 × HOLMES Buffer for Cas12a [pH 8.5]反應(yīng)體系中，37℃反應(yīng)條件下，1 min內(nèi)剪切1 pmol ssDNA探針?biāo)璧腃as12a酶量定義為1 transU。
例：若某批次enLbCas12a酶的反式切割活性為80.0 transU/pmol，則表明1 pmol的該批次enLbCas12a酶可在1 min內(nèi)，在上述指定的反應(yīng)條件下，反式切割80 pmol ssDNA探針。
實(shí)驗(yàn)流程
1. 順式剪切實(shí)驗(yàn)
| 組分 | 體積 | 終濃度 |
| 10×HOLMES Buffer for Cas12a | 2 μL | 1 × |
| 10 μM enLbCas12a Nuclease | 0.5 μL | 250 nM |
| 10 μM crRNA | 0.5 μL | 250 nM |
| 1 μM Target DNA b | 0.5 μL | 25 nM |
| Nuclease-free Water | Up to 20 μL |
b. 順式剪切體系中Target DNA可為ssDNA或帶PAM序列的dsDNA。
若用核酸電泳來分析順式剪切產(chǎn)物，建議使用dsDNA靶標(biāo)，因?yàn)閟sDNA靶標(biāo)會(huì)被反式激活的Cas12a進(jìn)一步切碎。對(duì)于20 μL順式剪切應(yīng)體系，推薦target DNA的使用量為100 ng～500 ng，且target DNA片段長(zhǎng)度在300 bp～3 kb范圍內(nèi)。不同長(zhǎng)度target DNA需要的Cas酶和crRNA的量需要根據(jù)target DNA的摩爾量計(jì)算，建議保持Cas酶:crRNA:target DNA的摩爾比為10:10:1，以盡量確保target DNA被剪切完全。
37℃反應(yīng)30 min ~ 1 h，85℃滅活5 min，核酸電泳分析順式剪切產(chǎn)物。
2. 反式剪切實(shí)驗(yàn)
| 組分 | 體積 | 終濃度 |
| 10×HOLMES Buffer for Cas12a | 2 μL | 1 × |
| 10 μM enLbCas12a Nuclease | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
| 10 μM crRNA | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
| 1 μM Target DNA c | 0.5~5 μL | 25~250 nM |
| 10 μM ssDNA Reporter | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
| Nuclease-free Water | Up to 20 μL |
c. 反式剪切體系中Target DNA可為ssDNA或帶PAM序列的dsDNA。
反式剪切體系中各組分的用量可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行調(diào)整，用量較少時(shí)可先將各組分稀釋后加入體系，enLbCas12a Nuclease可用1×HOLMES Buffer for Cas12a稀釋，稀釋后需立即使用（若要稀釋后的Cas12酶長(zhǎng)期保存，請(qǐng)使用Cas12 Dilution Buffer，#32012），crRNA、Target DNA及ssDNA Reporter可用Nuclease-free Water稀釋，但極低濃度的Target DNA（例如LOD實(shí)驗(yàn)）建議用0.1% Tween 20稀釋并使用低吸附的離心管、吸頭等耗材。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)熒光信號(hào)，37℃反應(yīng)，每30 sec采集一次熒光信號(hào)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
注意事項(xiàng)
1. 高活力的enLbCas12a酶crRNA的DR序列（Direct Repeat）與野生型LbCas12a（#32108）一致，可以在反應(yīng)體系中用enLbCas12a酶直接替換野生型LbCas12a。
2. 不同來源的Cas12a酶，其識(shí)別靶標(biāo)所需的PAM位點(diǎn)也略有不同，其中大部分Cas12a酶可識(shí)別TTN或TTTN位點(diǎn)。
3. Cas12a的順式剪切(cis-cleavage)：Cas12a在crRNA的引導(dǎo)下，特異性地剪切target DNA。dsDNA靶標(biāo)需帶有PAM位點(diǎn)，而ssDNA靶標(biāo)不依賴PAM位點(diǎn)。
4. Cas12a的反式剪切(trans-cleavage)：當(dāng)target DNA存在時(shí)，Cas12a/crRNA與target DNA形成三元復(fù)合物(Cas12a/crRNA/target DNA)，同時(shí)，Cas12a被激發(fā)反式剪切活性，將反應(yīng)體系中任意序列的單鏈DNA切碎。
5. 利用本產(chǎn)品的反式剪切活性進(jìn)行分子診斷實(shí)驗(yàn)，可參考本公司的HOLMES體系[1]。
6. 為防止RNase污染，請(qǐng)保持實(shí)驗(yàn)區(qū)干凈整潔，操作時(shí)需穿戴干凈的手套、口罩，實(shí)驗(yàn)所用槍頭、離心管等耗材均為RNase-free。
7. Cas12a酶對(duì)熱敏感，容易失活，應(yīng)全程冰上配置反應(yīng)體系，并在使用后立即將酶置于-20℃保存。
8. 本產(chǎn)品僅供科研使用。
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