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即便久未開展Western blot實(shí)驗(yàn)，只要手頭有一份完整可靠的實(shí)驗(yàn)方案（Protocol）及注意事項(xiàng)，且其中包含詳盡的細(xì)節(jié)提示，就能確保隨時(shí)能重新上手操作，盡可能減少失誤甚至避免出錯(cuò)，進(jìn)而提高WB實(shí)驗(yàn)的成功率。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1.收細(xì)胞：分選后或培養(yǎng)中的細(xì)胞，4℃，500g，離心5分鐘，棄上清，PBS洗2遍。
2.裂細(xì)胞：振蕩開細(xì)胞沉淀后，加入含終濃度為1mM PMSF（原液100x）的Western及IP裂解液或者RIPA裂解液（強(qiáng)），現(xiàn)配現(xiàn)用，冰上靜置10-20分鐘裂解細(xì)胞。
3.收上清：提前預(yù)冷離心機(jī)，4℃，14000g，10分鐘，移液槍吸取上清到新的冰上預(yù)冷的1.5mL離心管中。
4.測(cè)濃度：取原液或稀釋后，通過(guò)BCA法測(cè)定樣品的蛋白濃度（可選）。
5.煮蛋白：取一定體積的蛋白上清液，加入5×蛋白上樣緩沖液稀釋，充分混勻后，金屬浴95-100℃或水浴煮10分鐘，將樣品置于冰上降溫，瞬離后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>
6.制膠：根據(jù)目的蛋白大小，制備10%或12%濃度的SDS-PAGE蛋白膠，配制下層分離膠（試劑及配方見后），將其加注到玻璃夾板內(nèi)。隨后，用移液槍取無(wú)水乙醇進(jìn)行液封，操作時(shí)槍頭需平行貼住玻璃板，勻速緩慢加入。與水液封相比，無(wú)水乙醇液封的優(yōu)勢(shì)在于：能快速去除分離膠最上層的小氣泡；且加分離膠前不易殘留液體，可避免因液體殘留導(dǎo)致的膠面不均勻及橫向溢漏問(wèn)題。靜置20-30分鐘，待下層分離膠凝固后，倒掉液封用的無(wú)水乙醇，用衛(wèi)生紙吸附殘余乙醇，再靜置片刻，確保乙醇完全揮發(fā)干凈。配制上層濃縮膠（試劑及配方見后），將其沿玻璃板邊緣加注，直至合適高度。接著插入梳子，注意梳子需清洗干凈并擦干。插入時(shí)，先從左側(cè)將梳子放入，再緩慢下壓，直至右側(cè)卡入固定。
7.上樣：取出玻璃板，用跑膠夾板固定好。倒入1×電泳液以起到潤(rùn)滑作用，確保電泳液浸沒(méi)梳子及玻璃邊緣后，雙手保持平行，輕輕拔出梳子。隨后，用1ml移液槍吹拂每個(gè)上樣孔的邊緣及內(nèi)部，避免殘留的細(xì)碎膠堵塞上樣孔而干擾上樣。取對(duì)應(yīng)體積的蛋白樣品加入SDS-PAGE蛋白膠的上樣孔中，操作時(shí)需對(duì)準(zhǔn)上樣孔正中央勻速加入，注意防止樣品溢出。
8.跑膠：濃縮膠階段設(shè)置電壓為80V，電泳約20-30分鐘，直至觀察到樣品在濃縮膠底部拉平。分離膠階段調(diào)整電壓至120V，電泳時(shí)間需根據(jù)目標(biāo)蛋白大小確定，可通過(guò)觀察彩色Marker及所需分離效果，運(yùn)行40-120分鐘。注意分離膠最下層邊緣通常不均勻，后續(xù)轉(zhuǎn)膜時(shí)需將該部分裁切掉。
9.轉(zhuǎn)膜：PVDF膜0.22或0.45μm，裁剪到5x8cm基本上可以鋪滿整張蛋白膠，按實(shí)際需求分子量裁剪，需要標(biāo)記一般裁剪右上角或者鉛筆寫字。PVDF膜轉(zhuǎn)膜前需要先完全浸沒(méi)甲醇中激活30s左右，再浸沒(méi)到干凈的水中。通過(guò)轉(zhuǎn)膜儀將SDS-PAGE膠上的蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，90V或300mA，1.5-2小時(shí)；按照待檢測(cè)最大分子量蛋白，每1kDa轉(zhuǎn)1分鐘，可適當(dāng)延長(zhǎng)確保大蛋白的轉(zhuǎn)膜效果。
10.封閉：PVDF膜含蛋白的那一面朝上放。轉(zhuǎn)膜完成后0.1%PBST先潤(rùn)洗一遍PVDF膜。再用5%脫脂奶粉（用0.1%PBST配制），室溫，孵育1小時(shí)。脫脂奶粉一定要搖勻，不要有未溶解的渣點(diǎn)點(diǎn)。
11.一抗：用一抗稀釋液或者5%脫脂奶粉稀釋目標(biāo)抗體，合適比例，4℃，孵育過(guò)夜。如果是內(nèi)參蛋白，室溫孵育1小時(shí)先做也行。0.1%PBST洗3遍，每次5分鐘。
12.二抗：用二抗稀釋液或者5%脫脂奶粉稀釋HRP標(biāo)記的Anti-Mouse或者Anti-Rabbit二抗，室溫，孵育1小時(shí)。0.1%PBST洗3遍，每次5分鐘。
13.顯影：配制ECL發(fā)光液，1:1，現(xiàn)用現(xiàn)配。滴加到PVDF膜上浸沒(méi)，曝光儀顯影成像。
14.計(jì)算：計(jì)算條帶灰度值，和內(nèi)參比較目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。
制膠配方：
● 1mm厚的玻璃板，下層分離膠約4.5ml，上層濃縮膠約2ml。
● 1.5mm厚的玻璃板，下層分離膠約7ml，上層濃縮膠約3ml。
● 濃縮膠濃度不變，分離膠根據(jù)檢測(cè)目的蛋白的分子量調(diào)整濃度。
所有用到的試劑和抗體：
| 用途 | 名稱 | 品牌 | 貨號(hào) | 規(guī)格 |
| 蛋白樣品制備 | RIPA裂解液(強(qiáng)) | 沃博生物 | HC0242 | 100ML |
| IP,coIP,CHIP細(xì)胞組織通用裂解液 | 沃博生物 | WB30326 | 100ML | |
| PMSF 苯甲基磺酰氟 | 沃博生物 | M6890 | 1G | |
| Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free.100x in DMSO) |
沃博生物 | wb5016 | 1ML | |
| Benzonase Nuclease 全能核酸酶 | 沃博生物 | wb30310 | 25KU | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail (100×) 磷酸酶抑制劑混合物（100×) | 沃博生物 | wb5012 | 1ML | |
| Bovine Thrombin 牛凝血酶（高活力，>2000 IU/mg） | 沃博生物 | wb30420 | 1KU | |
| 動(dòng)物組織蛋白裂解液 | 莊盟生物 | ZD408 | 50ml | |
| 細(xì)菌細(xì)胞總蛋白提取試劑盒 | 莊盟生物 | ZD404 | 50T | |
| 細(xì)胞核蛋白/胞漿蛋白抽提試劑盒 | 莊盟生物 | ZD406 | 50T | |
| 植物蛋白提取試劑盒 | 莊盟生物 | ZD411 | 50T | |
| 蛋白濃度測(cè)定 | BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型) | 莊盟生物 | ZD301K-2 | 500T |
| 制膠 | 30% Acr-Bis(29:1) | 莊盟生物 | ZS310-3 | 500ml |
| 1M Tris-HCI,pH6.8 | 莊盟生物 | ZS701 | 100ml | |
| 1.5M Tris-HCl,pH8.8 | 莊盟生物 | ZS316A | 500ml | |
| 十二烷基硫酸鈉(SDS) | 沃博生物 | M3121 | 100G | |
| 一步法PAGE凝膠制備試劑盒（8% 10% 12% 15%) | 莊盟生物 | ZD304F | 125塊 | |
| 一步法PAGE免染凝膠制備試劑盒(免染制膠) | 莊盟生物 | ZD304G | 125塊 | |
| 小分子量蛋白凝膠制備套裝（100KD以下） | 莊盟生物 | ZD316-1 | 50T | |
| 蛋白預(yù)制膠（固定濃度） | 沃博生物 | wb30630 | 10塊 | |
| 跑膠 | 5xSDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液 | 沃博生物 | WB30320 | 2ML |
| 超快轉(zhuǎn)膜緩沖液（20X） | 沃博生物 | M4410 | 500ML | |
| 免脫蛋白快速染色液 | 沃博生物 | M4411 | 200ML | |
| 蛋白質(zhì)銀染試劑盒 | 莊盟生物 | ZD303-1 | 50T | |
| PageRuler™預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，10至180kDa | Thermo | 26616 | 250ul | |
| 低分子量蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(非預(yù)染) 14.4KDa – 116.0KDa | 莊盟生物 | ZD101 | 50T | |
| 彩色預(yù)染蛋白質(zhì)高分子量標(biāo)準(zhǔn)(10-310KDa) | 莊盟生物 | ZD115 | 50T | |
| 1xPBS緩沖液(pH7.2-7.4) | 莊盟生物 | ZS803 | 500ml | |
| Tween-20/吐溫-20 | 沃博生物 | M3233 | 100ml | |
| Immun-Blot PVDF Membrane, Roll, 26 cmx 3.3m | 密理博 | IPVH00010 | 卷 | |
| 1mm電轉(zhuǎn)濾紙7.5×10（轉(zhuǎn)印濾紙） | 莊盟生物 | ZD6666 | 50張/盒 | |
| 封閉 | 脫脂奶粉 | 沃博生物 | M3239 | 500G |
| 無(wú)蛋白快速封閉液(1×) | 沃博生物 | M4422 | 500ML | |
| Western封閉液(BSA型） | 莊盟生物 | ZS403 | 100ML | |
| 一抗 | Western一抗稀釋液 | 莊盟生物 | ZS402 | 500ML |
| β-Actin Antibody | abmart | P30002 | 50ul | |
| Actin (2P2) Antibody | abmart | M20011 | 50ul | |
| GAPDH (3B3) Antibody | abmart | M20006 | 50ul | |
| HA-Tag (26D11) Antibody | abmart | M20003 | 50ul | |
| MBP Antibody | abmart | T40007 | 50ul | |
| Anti-DYKDDDDK-Tag Antibody (Agarose conjugated) | abmart | M20018 | 500ul | |
| GST-Tag(12G8)Antibody | abmart | M20007 | 50ul | |
| GFP-Tag (7G9) Antibody | abmart | M20004 | 50ul | |
| Myc-Tag (19C2) Antibody | abmart | M20002 | 50ul | |
| His-Tag (2A8) Antibody | abmart | M20001 | 50ul | |
| DYKDDDDK-Tag (3B9) Antibody (Same as Sigma's Anti-FLAG® | abmart | M20008 | 50ul | |
| 二抗 | Goat Anti-Mouse IgG-HRP | abmart | M21001 | 100ul |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | abmart | M21001 | 100ul | |
| Goat Anti-Rabbit Mouse IgG-HRP | abmart | M21003 | 100ul | |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | 沃博生物 | ab9819 | 100ul | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | 沃博生物 | ab9816 | 100ul | |
| Alexa Fluor 488-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | 沃博生物 | ab9828 | 100ul | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | 沃博生物 | ab9814 | 100ul | |
| FITC-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | 沃博生物 | ab9815 | 100ul | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | 沃博生物 | ab9818 | 100ul | |
| 顯影 | 高敏ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（發(fā)光液） | 莊盟生物 | ZD310 | 100ML |
| 超敏ExPlus ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑 | 莊盟生物 | ZD310A | 100ML | |
| 洗膜重孵 | Western一抗二抗去除液( 膜再生液 / Western抗體洗脫液 ) | 莊盟生物 | ZS406 | 250ML |
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